Новый аденовирус у летучих мышей, Германия

  1. Аннотация
  2. Учеба
  3. Таблица 1
  4. Таблица 2
  5. Выводы
  6. Подтверждения
  7. биография
  8. Сноски
  9. Рекомендации

Emerg Infect Dis. 2009 дек; 15 (12): 2052–2055.

Институт Роберта Коха, Берлин, Германия (М. Соннтаг, А. Курт)

Институт исследований зоопарка и дикой природы им. Лейбница, Берлин (К. Мюльдорфер, С. Спек. Г. Виббелт)

Адрес для переписки: Андреас Курт, Центр биологической безопасности 1, Институт Роберта Коха, Берлин, Германия; Эл. адрес: [email protected] Эта статья была цитируется другие статьи в PMC.

Аннотация

Мы проверили 55 умерших летучих мышей vespertilionid 12 видов из южной Германии на вирусные инфекции. Новый аденовирус был выделен из образцов ткани 2 летучих мышей Pipistrellus pipistrellus , который представляет собой единственный изолят вируса хироптеран, найденный в Европе, кроме лиссавируса (вирус бешенства). Были найдены доказательства передачи аденовируса между летучими мышами.

Ключевые слова: выделение вируса, летучая мышь-веспертилонид, аденовирус, VIDISCA PCR, Pipistrellus pipistrellus, универсальная ПЦР, мастаденовирус, передача вируса, Chiroptera, вирусы, отправка

После недавних открытий вируса Эбола, генипавируса и тяжелых коронавирусных инфекций, связанных с острым респираторным синдромом, интерес к роли летучих мышей как хозяев для патогенов заметно возрос ( 1 ). За исключением всемирных исследований летучих мышей ( 2 ), большинство вирусологических исследований на летучих мышах ограничивалось определенным зоонозным агентом, вовлеченным в географически локализованную вспышку заболевания ( 3 - 5 ). В остальных исследованиях были обнаружены различные с медицинской точки зрения менее важные вирусы у летучих мышей в Америке, Африке, Азии и Австралии ( 1 , 6 ). В результате активизации исследовательских работ, касающихся летучих мышей и инфекционных заболеваний в Европе, недавно были обнаружены 2 новые группы вирусов, а именно бета- и гамма-герпесвирусы в тканях органов ( 7 ) и коронавирусы I группы в кале европейских летучих мышей 8 ). Однако, поскольку все виды летучих мышей в Европе / Германии защищены строгими правилами, получение подходящих образцов для выделения вируса является довольно сложной задачей по сравнению с большинством других частей мира.

Учеба

Мы провели обширный поиск неизвестных вирусов у 55 немецких летучих мышей с вестерлионидом, основанный как на общих анализах ПЦР, так и на методах выделения вируса, в рамках более широкого исследования, посвященного изучению гистопатологических изменений у немецких летучих мышей в связи с инфекционными патогенами. Умершие или умирающие летучие мыши из 12 видов ( Barbastella barbastellus, Eptesicus nilssoni, E. serotinus, Myotis daubentonii, M. mystacinus, Nyctalus leisleri, N. noctula, Pipistrellus kuhli, P. nathusii, P. pipistrellur aurusususurusus, Plecotusus), Plecotusus и Plecootus ) были собраны в сертифицированных центрах реабилитации летучих мышей на юге Германии и были исследованы макроскопически, бактериологически и гистологически.

Для вирусологического исследования гомогенизированную ткань органа инокулировали на клетки VeroE6 / 7 и ежедневно проверяли на цитопатические эффекты. Оставшийся материал ткани использовали для выделения РНК / ДНК и дальнейшего молекулярного анализа с помощью общих анализов ПЦР для выявления членов нескольких семейств вирусов, включая флавивирусы, хантавирусы, коронавирусы, ортомиксовирусы и парамиксовирусы. Виды летучих мышей определяли путем амплификации и секвенирования гена цитохрома B ( cytB ), стандартного метода идентификации видов ( 9 ).

Из протестированных образцов от 55 летучих мышей вирус был первоначально обнаружен только у 2 взрослых распространенных пипистреллов ( P. pipistrellus , №№ 198/07 и 199/07). Цитопатический эффект был обнаружен в клетках Vero E6 / 7 после второго пассажа, что указывает на присутствие вируса в клеточной культуре. Очищенный супернатант этих клеточных культур подвергали электронной микроскопии с отрицательным окрашиванием, которая показала многочисленные аденовирусоподобные частицы (панель A). Семейство Adenoviridae было подтверждено первой реакцией общей аденовирусной специфической вложенной ПЦР ( 10 ). Полученная последовательность фрагмента гена ДНК-полимеразы (≈550 п.н.) указывает на то, что вирусы были новым типом вируса в пределах рода Mastadenovirus и предварительно были названы штаммом летучей мыши-аденовируса 2 (летучая мышь AdV-2) P. pipistrellus virus 1 (PPV1). ).

)

А) Электронная микрофотография аденовирусных частиц, выделенных из Pipistrellus pipistrellus bat 199/07, Германия. Отрицательно окрашивается 1% уранилацетатом. Частицы вируса имели диаметр 70–90 нм икосаэдрической формы. Масштабная линейка = 100 нм. Б) Схематическое изображение геномных фрагментов, полученных из аденовируса летучей мыши 2 (номер доступа в GenBank. {"type": "entrez-nucleotide", "attrs": {"text": "FJ983127", "term_id": "269979836", "term_text": "FJ983127"}} FJ983127 ) в соответствии со штаммом собачьего аденовируса 2 Toronto A26 / 61 (регистрационный номер GenBank. {"type": "entrez-nucleotide", "attrs": {"text": "U77082", "term_id": "1732265", "term_text": "U77082"}} U77082 ). Геномные фрагменты были получены с помощью общей аденовирус-специфической ПЦР ( 10 ) и обнаружение вируса на основе метода ПЦР полиморфизма длин амплифицированных кДНК фрагментов ( 11 ). Частичная последовательность гена ДНК-полимеразы была получена из продукта ПЦР LongRange. Очищенные ПЦР-продукты непосредственно секвенировали с использованием готового набора реакционных средств BigDye Terminator Cycle Sequencing (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) и анализировали на автоматическом секвенаторе ABI 3770 (Applied Biosytems). С, клон; P, вложенный продукт ПЦР ≈550 п.н.

Для получения дополнительной информации о последовательности летучей мыши AdV-2, методом случайной ПЦР (обнаружение вируса на основе полиморфизма длин амплифицированных кДНК фрагментов) ( 11 ), который показал> 20 аденовирусных последовательностей, распределенных по геному (панель В). Неполная последовательность ДНК-полимеразы летучей мыши AdV-2 (3408 п.н .; номер доступа GenBank. {"type": "entrez-nucleotide", "attrs": {"text": "FJ983127", "term_id": "269979836", "term_text": "FJ983127"}} FJ983127 ) был получен после LongRange PCR с использованием Expand Long Range dNTPack (Roche, Mannheim, Germany) в соответствии с указаниями производителя и следующими 2 праймерами: ABS F1-B (5'-AAAAgAggCAAAgCAAgACAgTgg-3 ') и ABS R2-B ( 5'-ggCgggCAACAAAgACCTCA-3 '). После повторного анализа последовательности гена частичной ДНК-полимеразы для проверки мы обнаружили, что идентичность летучей мыши AdV-2 PPV1 с близкородственными аденовирусами варьировала от 68% до 74% на уровне нуклеиновой кислоты (), при этом была обнаружена наиболее близкая связь с аденовирусами собак. 1 и 2. До настоящего времени единственный другой аденовирус у летучих мышей был случайно выделен из первичных клеток почки летучей мыши здоровой летучей лисицы Рюкю ( Pteropus dasymallus yayeyamae ) ( 12 ), который, как оказалось, имеет довольно отдаленное филогенетическое отношение к летучей мыши AdV-2 ().

Таблица 1

Идентичность последовательностей (%) частичного гена ДНК-полимеразы (3408 п.н.) между летучей мышью AdV-2 и выбранными аденовирусами, Германия *

Вирус Собачий AdV-2 Собачий AdV-1 Свинина AdV-5 Человек AdV-26 Симьян AdV-7 Бычий AdV-2 Древесная стропила AdV-1 Летучая мышь AdV-2 PPV1 74 72 70 69 69 68 68 Вирус Собачий AdV-2 Собачий AdV-1 Свинина AdV-5 Человек AdV-26 Симьян AdV-7 Бычий AdV-2 Древесная стропила AdV-1 Летучая мышь AdV-2 PPV1 74 72 70 69 69 68 68

Филогенетическое дерево, построенное с использованием множественного выравнивания ампликонов ≈550 п.н., состоящего из частичного гена ДНК-полимеразы нового штамма летучей мыши-аденовируса 2 Pipistrellus pipistrellus virus 1 ( жирным шрифтом ; номер доступа в GenBank №. {"type": "entrez-nucleotide", "attrs": {"text": "FJ983127", "term_id": "269979836", "term_text": "FJ983127"}} FJ983127 ) и избранных членов семьи Adenoviridae , Германия. Выравнивание было проанализировано с помощью метода соединения соседей и модели p-расстояния в MEGA4 ( www.megasoftware.net ). Значения начальной загрузки (1000 повторов)> 35% указаны в узлах ветвления. Длина ветви пропорциональна эволюционному расстоянию (масштабная линейка). Аденовирусные роды указаны.

На основе вновь полученной информации о последовательности мы разработали специальную ПЦР TaqMan в реальном времени для обнаружения летучих мышей AdV-2 (ABS вперед 5′-CACAAgTggTgTCTTTgAgAgCA-3 ′, ABS обратный 5′-AgAgggATACAAACTgATggAAACA-3 ′, ABS TM 6FAM-CTAGTAGTAGTGGT -q). Условия циклирования были следующими: предварительная денатурация (95 ° C в течение 10 минут), 45 циклов амплификации (95 ° C в течение 30 с, 61 ° C в течение 30 с, 72 ° C в течение 30 с) и окончательное удлинение (72 ° C для 10 минут).

После скрининга всех 55 летучих мышей из Германии 12 видов, включающих дополнительные 11 общих пипистреллов, идентичный аденовирус был обнаружен в 1 дополнительной общей пипистрелле. Кроме того, тканевой тропизм летучих мышей AdV-2 был исследован у всех 3 зараженных летучих мышей (). Из всех тестируемых органов у летучих мышей AdV-2 был обнаружен в больших количествах копий ДНК в кишечнике у всех трех летучих мышей с меньшим числом копий ДНК в печени и почках, тогда как в других органах ДНК аденовируса была незначительной или отсутствовала. К сожалению, из-за прогрессирующего разложения тканей в большинстве органов, включая печень, почки и кишечник, тщательное гистопатологическое исследование 3 летучих мышей было заметно нарушено.

Таблица 2

Распределение количества копий ДНК летучей мыши AdV-2 в различных органах одинакового размера у зараженных летучих мышей Pipistrellus pipistrellus , Германия * †

Летучая мышь № Кишечник Печень Почка Легкое Сердце Мозг Селезенка 198/07 +++++ +++ ++++ + - - ND 199/07 ++++++ ++++ +++ + + - ND 200/07 + ++++++ +++ ++ + - - ++

Выводы

В отличие от Maeda et al. ( 12 ), который постулировал необходимость первичных клеток летучей мыши для выделения вируса ДНК из рукокрылых, наша изоляция ДНК-вируса от европейской летучей мыши в постоянной клеточной линии (клетки почек обезьяны) доказала обратное. Мы полагаем, что редкое обнаружение и выделение вирусов может быть связано с быстрой естественной деградацией летучих мышей подотряда Microchiroptera по сравнению с таковой у других туш животных, скорее всего из-за их чрезвычайно низкого веса (2–10 г). Хотя вирусы не были обнаружены с помощью различных общих анализов ПЦР из гомогенизированных образцов замороженной ткани, мы выделили новый вирус из гибернации насекомоядных видов летучих мышей. Этот вирус был обнаружен в большом количестве копий ДНК в кишечнике 3 летучих мышей, которые умерли по естественным причинам.

Тот факт, что у этих животных не было обнаружено других вирусных или бактериальных агентов, указывает на клиническую корреляцию с выделенным аденовирусом. Более того, все 3 летучих мыши принадлежали к одному виду и были одинакового возраста. За несколько дней до их смерти они были найдены умирающими и впоследствии помещены вместе в реабилитационный центр, что указывает на высокую вероятность заражения в колонии происхождения. Перекрестное загрязнение во время подготовки ткани может быть исключено, потому что стерилизованные инструменты использовались для каждого животного, и после каждого разреза инструменты очищались с помощью 70% этанола и пламени горелки Бунзена для уничтожения прилипших остатков ткани.

Различные типы аденовирусов рода Mastdenovirus заражают целый ряд различных млекопитающих и вызывают респираторные, глазные и желудочно-кишечные заболевания. Здесь, у всех 3 инфицированных летучих мышей, наибольшее количество копий аденовирусной ДНК было обнаружено в кишечнике, что указывает на корреляцию с желудочно-кишечным заболеванием. Известно, что спектр хозяев мастаденовирусов ограничен одним (или несколькими близкородственными) видами млекопитающих ( 13 ) с вероятной коэволюцией между вирусом и его хозяевами ( 14 ). Полученная частичная последовательность ДНК-полимеразы летучих мышей AdV-2, наиболее близкая к аденовирусу собак (всего 74% на уровне нуклеиновых кислот), и выделение из нового животного-хозяина позволяет предположить, что этот вирус является новым видом аденовирусов в составе рода Mastadenovirus. , Сравнение с единственным другим аденовирусом, обнаруженным у летучей мыши (летучая лисица, отряд Megachiroptera), с доступной информацией о последовательности фрагмента гена ДНК-полимеразы в ≈550 п.н. показало их отдаленную связь. Это строгое разделение отражает либо коэволюционное развитие между 2 аденовирусами (bat AdV-1 FBV1, bat AdV-2 PPV1) и их семействами-хозяевами Pteropodidae и Vespertilionidae, либо переключением хозяина вируса, происходящего от еще не определенного хозяина позвоночных. Чтобы выяснить эту проблему, необходимы дальнейшие исследования.

В заключение, мы выделили новый вирус из летучих мышей со свободным везением, который представляет собой единственный изолят вируса хироптеран, кроме лиссавируса (бешенства), найденного в Европе. Кроме того, обнаружение этого вируса хироптеран может быть связано с его передачей между отдельными летучими мышами, живущими в непосредственной близости от других летучих мышей.

Подтверждения

Мы благодарны протекционистам летучих мышей за сбор летучих мышей; Юнг-Вон Сим-Бранденбург, Юлия Теш и Анджелина Кус за отличную техническую помощь; Андреас Нитче за разработку анализа ПЦР в реальном времени для летучих мышей AdV-2; и Урсула Эрикли и Алан Карри за их преданную редакционную помощь.

биография

Г-н Соннтаг - студент магистратуры в Центре биологической безопасности, Институт Роберта Коха, Берлин. Его основной исследовательский интерес - изоляция и молекулярная характеристика патогенов человека и животных с особым акцентом на возникающие вирусные инфекции.

Сноски

Предлагаемая цитата для этой статьи : Sonntag M, Mühldorfer K, Speck S, Wibbelt G, Kurth A. Новый аденовирус у летучих мышей, Германия. Emerg Infect Dis [сериал в интернете]. 2009 декабрь [указанная дата ]. Доступна с http://www.cdc.gov/EID/content/15/12/2052.htm

Рекомендации

1. Wibbelt G, Speck S, Field H Методы оценки заболеваний у летучих мышей. В кн .: Кунц Т.Х., Парсонс С., редакторы. Экологические и поведенческие методы изучения летучих мышей. Балтимор (Мэриленд): издательство Университета Джонса Хопкинса; 2009. с. 775-794. [ Google ученый ] 2. Джонсон Н., Уэйкли П.Р., Брукс С.М., Фукс А.Р. Европейская летучая мышь-лисавирус типа 2 в Myotis daubentonii. Emerg Infect Dis. 2006; 12: 1142–4 [ PMC бесплатная статья ] [ PubMed ] [ Google ученый ] 3. Хэлпин К., Янг П.Л., Филд Х.Э., Макензи Дж.С. Выделение вируса Хендры из птеропидных летучих мышей: естественный резервуар вируса Хендры. J Gen Virol. 2000; 81: 1927–32 [ PubMed ] [ Google ученый ] 4. Чуа К.Б., Ко К.Л., Хой П.С., Ви К.Ф., Хонг Дж. Х., Чуа Б.Х. и др. Выделение вируса Нипах из лисиц острова Малайзии. Инфекция микробов. 2002; 4: 145–51 10.1016 / S1286-4579 (01) 01522-2 [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google ученый ] 5. Lau SK, Woo PC, Li KS, Huang Y, Tsoi HW, Wong BH, et al. Тяжелый острый респираторный синдром коронавирусоподобного вируса у китайских подковообразных летучих мышей. Proc Natl Acad Sci USA. 2005; 102: 14040–5 10,1073 / pnas.0506735102 [ PMC бесплатная статья ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google ученый ] 6. Calisher CH, Childs JE, Field HE, Holmes KV, Schountz T Bats: важные резервуары-хозяева новых вирусов. Clin Microbiol Rev. 2006; 19: 531–45 10.1128 / CMR.00017-06 [ PMC бесплатная статья ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google ученый ] 7. Wibbelt G, Kurth A, Yasmum N, Bannert M, Nagel S, Nitsche A, et al. Обнаружение герпесвирусов у летучих мышей. J Gen Virol. 2007; 88: 2651-5 10.1099 / vir.0.83045-0 [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google ученый ] 8. Gloza-Rausch F, Ipsen A, Seebens A, Göttsche M, Panning M, Drexler JF, et al. Выявление и распространенность коронавирусов I группы у летучих мышей, северная Германия. Emerg Infect Dis. 2008; 14: 626–31 10,3201 / eid1404.071439 [ PMC бесплатная статья ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google ученый ] 9. Linacre A, Lee JC. Определение видов: роль и использование гена цитохрома b. Методы Мол Биол. 2005; 297: 45–52 [ PubMed ] [ Google ученый ] 10. Веллехан Дж. Ф., Джонсон А. Дж., Харрач Б., Бенко М., Пессиер А. П., Джонсон С. М. и др. Обнаружение и анализ шести аденовирусов ящериц с помощью ПЦР с использованием консенсусного праймера является дополнительным доказательством происхождения рептилий для атаденовирусов. J Virol. 2004; 78: 13366–9 10.1128 / JVI.78.23.13366-13369.2004 [ PMC бесплатная статья ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google ученый ] 11. van der Hoek L, Pyrc K, Jebbink MF, Vermeulen-Oost W, Berkhout RJ, Wolthers KC, et al. Выявление нового коронавируса человека. Nat Med. 2004; 10: 368–73 10,1038 / нм1024 [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google ученый ] 12. Maeda K, Hondo E, Terakawa J, Kiso Y, Nakaichi N, Endoh D, et al. Выделение нового аденовируса из плодовой летучей мыши ( Pteropus dasymallus yayeyamae ). Emerg Infect Dis. 2008; 14: 347–9 10,3201 / eid1402.070932 [ PMC бесплатная статья ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google ученый ] 13. Schrenzel M, Oaks JL, Rotstein D, Maalouf G, Snook E, Sandfort C, et al. Характеристика нового вида аденовируса у соколов. J Clin Microbiol. 2005; 43: 3402–13 10.1128 / JCM.43.7.3402-3413.2005 [ PMC бесплатная статья ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google ученый ] 14. Харрах Б. Аденовирусы: общие черты. В: Mahy BW, van Regenmortel MH, редакторы. Энциклопедия вирусологии. Оксфорд: Elsevier; 2008. с. 1-9. [ Google ученый ] Статьи о возникающих инфекционных заболеваниях предоставлены здесь благодаря Центрам по контролю и профилактике заболеваний.