Центральный путь Sirtuin 1 / p53 необходим для оксигенного действия грелина

  1. ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ДИЗАЙН И МЕТОДЫ
  2. Пищевой статус.
  3. Имплантация интрацеребровентрикулярных канюль.
  4. Внутрицеребровентрикулярное лечение.
  5. Вестерн-блоттинг.
  6. Гибридизация in situ.
  7. ТАБЛИЦА 1
  8. Плазменный ответ гормона роста.
  9. Гормональные анализы.
  10. Статистический анализ и представление данных.
  11. РЕЗУЛЬТАТЫ
  12. Блокада пути SIRT1 / p53 притупляет орексигенное действие грелина.
  13. р53 не опосредует орексигенное действие AICAR.
  14. Центральный путь SIRT1 не модулирует индуцированную грелином секрецию GH.
  15. ОБСУЖДЕНИЕ

Грелин является единственным известным эндогенным сигналом, стимулирующим ожирение и кормление ( 1 - 3 ). На уровне гипоталамуса грелин активирует АМФ-активированную протеинкиназу (АМФК), вызывая соответствующие изменения в дыхании митохондрий гипоталамуса и продукцию активных форм кислорода ( 4 - 6 ), изменяя экспрессию факторов транскрипции Bsx, Forkhead box класса O (FoxO1) и cAMP-чувствительного элемента, связывающего белок (pCREB), и приводя к окончательной активации агути-связанных пептид / нейропептид Y (AgRP / NPY) нейронов , Однако молекулярные механизмы, возникающие после активации GHS-R1a и до фосфорилирования AMPK, полностью неизвестны. Грелин является единственным кишечным пептидом с орексигенными свойствами у грызунов и людей; таким образом, система грелина уникально позиционируется как лекарственная мишень для лечения кахексии. В настоящем исследовании была проверена гипотеза о том, что центральный путь sirtuin 1 (SIRT1) / p53 может опосредовать орексигенное действие грелина.

SIRT1 является NAD + -зависимой деацетилазой, которая действует на важные опухолевые супрессоры, такие как р53. В дополнение к их биологическому действию на рак, SIRT1 и p53 также важны в некоторых метаболически значимых тканях. SIRT1 контролирует различные метаболические пути в жировой ткани ( 7 ), печень ( 8 ), панкреатические β-клетки ( 9 ) и скелетные мышцы ( 10 ), главным образом посредством регуляции ограничивающих скорость ферментов, участвующих в метаболизме глюкозы и липидов. Недавние сообщения показали, что центральный SIRT1 также регулирует гомеостаз энергии и глюкозы ( 11 - 17 ). С другой стороны, р53 активируется из-за недостатка питательных веществ в результате активации AMPK, а активность старения р53 способствует развитию резистентности к инсулину ( 18 ).

Поскольку молекулярные механизмы, которые связывают эффекты системы грелина / GHS-R1a с AMPK, неизвестны, в настоящем исследовании была проверена гипотеза о том, что гипоталамический путь SIRT1 / p53 может опосредовать орексигенное действие грелина.

ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ДИЗАЙН И МЕТОДЫ

Животные модели.

Самцов крыс Sprague-Dawley (8 недель, 200–250 г) и мышей C57 / B6 (8 недель) содержали в кондиционированных комнатах (22–24 ° C) в течение 12/12-часового цикла свет / темнота и кормили стандартным чау. Мыши p53-null (8–10 недель, смешанные фоновые C57BL / 6J и 129 / Sv) были описаны ранее ( 19 ). Гомозиготные мыши дикого типа (WT) и нокауты (KO) происходили из гетерозиготных спариваний, поэтому в каждом эксперименте сравнивали только животных с однопометным WT и KO. Животных лечили и убивали, когда им было от 12 до 14 недель до появления каких-либо признаков заболеваемости, возникающих в результате развития опухоли. Животные были убиты обезглавливанием между 1000 и 1200 часами. Эксперименты на животных проводились в соответствии со стандартами, утвержденными Комитетом животных факультета в Университете Сантьяго-де-Компостела, и эксперименты проводились в соответствии с Правилами лабораторного ухода за животными и международным законодательством об экспериментах на животных.

Пищевой статус.

Крысы ( n = 8 на группу) были отнесены к одной из следующих групп: кормили ad libitum, лишали пищи в течение 48 часов и голодали в течение 48 часов и перекармливали в течение 24 часов. Все животные имели свободный доступ к водопроводной воде.

Имплантация интрацеребровентрикулярных канюль.

Крыс анестезировали путем внутрибрюшинной инъекции кетамина (100 мг / кг массы тела) / ксилазина (15 мг / кг массы тела). Мышей анестезировали путем внутрибрюшинной инъекции трибромэтанола (480 мг / кг; Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури). Интрацеребровентрикулярные канюли были имплантированы стереотаксически крысам ( 20 ) или мыши ( 21 ), как описано ранее.

Внутрицеребровентрикулярное лечение.

Крысы получали интрацеребровентрикулярное введение 5 мкл носителя или грелина (5 мкг; Bachem, Bubendorf, Швейцария). Для ингибирования SIRT1 мы использовали два сильнодействующих специфических ингибитора SIRT1: Ex527 (от 1 до 5-10 мкг в общем объеме 5 мкл; Tocris Bioscience, St. Louis, MO) ( 22 ) и сиртинол (от 1 до 5-10 мкг в общем объеме 5 мкл; Tocris Bioscience) ( 23 ) до администрации грелина. Для экспериментов с участием только двух групп (носитель против грелина) носителем был солевой раствор. В экспериментах с ингибиторами SIRT1 носителем был ДМСО, поскольку Ex527 и сиртинол были разбавлены в ДМСО. Мыши получали интрацеребровентрикулярное введение носителя, грелина (5 мкг) или AICAR (3 мкг; Sigma-Aldrich A9978) в общем объеме 2 мкл. Для экспериментов, связанных с транспортным средством против грелина и транспортным средством против AICAR, транспортное средство представляло собой солевой раствор.

Мы использовали одну и ту же дозу грелина как для крыс, так и для мышей, поскольку было показано, что эта доза эффективна у обоих видов ( 2 ). Мы использовали восемь крыс на группу, и эксперименты повторяли, по крайней мере, дважды. Крысы были убиты смещением шейных позвонков. Гипоталамы иссекали и хранили при -80 ° С до дальнейшей обработки.

Вестерн-блоттинг.

Гипоталами гомогенизировали в ледяном буфере для лизиса, содержащем 50 ммоль / л Трис-HCl (рН 7,5), 1 ммоль / л EGTA, 1 ммоль / л ЭДТА, 1% Тритон Х-100, 1 ммоль / л ортованадата натрия, 50 ммоль / Л фторида натрия, 5 ммоль / л пирофосфата натрия, 0,27 моль / л сахарозы, 0,1% 2-меркаптоэтанола и полный коктейль ингибитора протеазы (1 таблетка / 50 мл; Roche Diagnostics, Мангейм, Германия). Гомогенаты центрифугировали при 13000 g в течение 10 минут при 4 ° С, супернатанты удаляли и аликвоты быстро замораживали в жидком азоте. Лизат гипоталамуса (40 мкг) подвергали SDS-PAGE на 6% полиакриламидных гелях и подвергали электропереносу на поливинилиденфторидную мембрану.

Мембраны блокировали в течение 1 часа в TBS-Tween 20 (TBST: 50 ммоль / л Трис-HCl [pH 7,5], 0,15 моль / л NaCl и 0,1% Tween 20), содержащего 5% обезжиренного молока или 3% BSA (для pAMPK Thr172 и pACC Ser79) и исследовали в течение 16 ч при 4 ° C в TBST, 5% обезжиренном молоке или 3% BSA (для pAMPK Thr172, pACC Ser79, SIRT1 и ацетил-p53-Lys379) с соответствующим разведением указанного антитела (ацетил-КоА-карбоксилаза [ACC]: 1: 1500; pACC: 1: 2000; AMPKα1: 1: 1000; AMPKα2: 1: 1000; pAMPK: 1: 2000; β-актин (контроль нагрузки): 1: 2000) , ACC выявляли с использованием стрептавидина, конъюгированного с пероксидазой хрена (HRP), (Amersham Biosciences, Little Chalfont, Великобритания).

Детекцию белков проводили с использованием вторичных антител, конъюгированных с HRP, и усиленного хемилюминесцентного реагента (Amersham Biosciences). Мы использовали от 8 до 12 гипоталами в экспериментальной группе. Ацетил-p53-Lys379 был получен от Cell Signaling (Danvers, MA). ACCα, pACCα-Ser79, AMPKα1 и AMPKα2 были получены от Upstate Biotechnology (Temecula, CA); pAMPKα-Thr172 от клеточной сигнализации; синтаза жирных кислот (FAS), pCREB и FoxO1 от Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA); и β-актин от Abcam (Кембридж, Великобритания), как описано ранее ( 6 ).

Для анализов блоттинга эксперименты были разделены на две группы: крысы Sprague-Dawley и мыши (WT и p53 KO), обработанные грелином или AICAR и проанализированные с использованием непараметрического критерия Манна-Уитни. В экспериментах, состоящих из четырех групп (крысы Sprague-Dawley, получавшие носитель, грелин, Ex527 и Ex527 + грелин или носитель, грелин, сиртинол и сиртинол + грелин), данные были проанализированы с помощью двухстороннего ANOVA с последующим с помощью многократного сравнительного теста (тест Тьюки).

Гибридизация in situ.

Корональные срезы гипоталамуса (16 мкм) разрезали на криостате и сразу хранили при -80ºC до гибридизации. Для обнаружения мРНК AgRP, NPY и Bsx мы использовали специфические антисмысловые олигодезоксинуклеотиды (). Эти зонды были мечены с 3'-конца [35S] дезокси-АТФ с использованием терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы. Специфичность зондов была подтверждена путем инкубации срезов с избытком немеченых зондов, как сообщалось ранее ( 24 , 25 ). Гибридизации in situ проводили, как сообщалось ранее ( 24 , 25 ).

ТАБЛИЦА 1

Антисмысловые олигонуклеотиды для анализа гибридизации in situ

Замороженные срезы фиксировали 4% параформальдегидом в фосфатном буфере (0,1 моль / л, рН 7,4) при комнатной температуре в течение 30 минут. Их обезвоживали с использованием 70%, 80%, 90%, 95% и 100% этанола в течение 5 минут каждый. Гибридизацию проводили в течение ночи при 37 ° С во влажной камере. Гибридизационный раствор содержал 5 × 105 (AgRP и Bsx) или 1 × 106 импульсов в минуту (NPY) на предметное стекло меченого зонда, 4 × стандартный солевой цитрат (SSC), 50% деионизированный формамид, 1 × раствор Денхардта, 10% декстрансульфат и 10 мкг / мл сдвинутой одноцепочечной ДНК спермы лосося.

После этого секции гибридизации последовательно промывали в 1 × SSC при комнатной температуре, четыре раза в 1 × SSC при 42ºC (30 мин / промывка) и один раз в 1 × SSC при комнатной температуре (1 ч), а затем промывали в воде и этиловый спирт. Наконец, срезы высушивали на воздухе и подвергали воздействию Hyperfilm β-Max (Amersham Biosciences) при комнатной температуре в течение 4-6 дней для AgRP и NPY и в течение 21 дня для Bsx. Слайды были разработаны в проявителе Kodak D-19 (Eastman Kodak Co., Rochester, NY), зафиксированы (фиксатор Kodak) и окрашены метиленовым синим.

Чтобы сравнить анатомически сходные области, слайды были сопоставлены в соответствии с Paxinos и Watson ( 26 ). Слайды от контрольных и обработанных животных в каждый момент обработки всегда подвергали воздействию одной и той же авторадиографической пленки. Все срезы были отсканированы, и специфический гибридизационный сигнал был количественно оценен денситометрией с использованием системы цифровой визуализации Molecular Analyst (Bio-Rad Laboratories Inc., Ричмонд, Калифорния). Оптическую плотность гибридизационного сигнала определяли и затем корректировали по оптической плотности его смежного фонового значения. По этой причине был нарисован прямоугольник с одинаковыми размерами в каждом случае, заключающий в себе сигнал гибридизации над каждым ядром и над смежными областями мозга каждого сечения (фон). Мы использовали от 16 до 20 секций для каждого животного (4–5 слайдов, 4 секции / слайд). Среднее из этих 16-20 значений использовали в качестве значения денситометрии для каждого животного.

Плазменный ответ гормона роста.

Хронические интрацеребровентрикулярные и внутрисердечные канюли имплантировали под наркозом кетамин / ксилазин, как описано выше. После операции животных помещали в камеры для изоляции на 5 дней, и им давали свободный доступ к обычным кормам для крыс и водопроводной воде. В день эксперимента образцы крови (0,3 мл) отбирали в подходящее время. Животные ( n = 7–9 крыс / группа) получали носитель, грелин (12 нмоль / кг в / в), Ex527 (1 мкг icv) или Ex527 + грелин.

Гормональные анализы.

Концентрации гормона роста плазмы (GH) определяли радиоиммуноанализом с использованием двух антител с использованием материалов, предоставленных Национальной программой по гипофизу гормонов, как описано ранее ( 27 ). Значения выражены в единицах эталонной подготовки GH (GH-RP-2). Коэффициенты вариации внутри и между анализами составляли 7 и 10% соответственно.

Статистический анализ и представление данных.

Эксперименты были разделены на две группы: крысы Sprague-Dawley и мыши (WT и p53 KO), обработанные грелином или AICAR и проанализированные с использованием непараметрического критерия Манна-Уитни. В экспериментах, состоящих из четырех групп (крысы Sprague-Dawley, получавшие носитель, грелин, Ex527 и Ex527 + грелин и носитель, грелин, сиртинол и сиртинол + грелин), данные были проанализированы с помощью двустороннего анализа ANOVA, а затем многократный сравнительный тест (тест Тьюки). Данные выражены в виде среднего значения ± стандартная ошибка среднего и проанализированы с использованием программного обеспечения PASW Statistics 18.0 (SPSS Inc., Чикаго, Иллинойс). Значение P <0,05 считалось значимым.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Регулирование SIRT1 по состоянию питания.

У крыс, голодавших в течение 48 часов, наблюдалась потеря массы тела, тогда как повторное кормление в течение 24 часов частично приводило к значительному выздоровлению (). Уровни ацетил-р53, маркер активности SIRT1 in vivo ( 28 ) были снижены в гипоталамусе голодных крыс ( F 2,18 = 3,661, P <0,05), тогда как эти уровни были аналогичны исходным уровням у крыс после повторного кормления (). Поскольку грелин является ключевым игроком для улучшения пищевого поведения, мы проверили гипотезу о том, что центральное введение грелина может стимулировать гипоталамическую активность SIRT1. Как сообщалось ранее, грелин увеличивал потребление пищи через 2 ч ( F 1,13 = 24,161, P <0,001;) и 6 ч ( F 1,13 = 36,14, P <0,001;) ( 29 ) и снижение уровня ацетил-р53 в гипоталамусе через 2 часа ( F 1,13 = 7,915, P <0,01;) и через 6 часов ( F 1,13 = 7,645, P <0,05;).

Как сообщалось ранее, грелин увеличивал потребление пищи через 2 ч ( F 1,13 = 24,161, P <0,001;) и 6 ч ( F 1,13 = 36,14, P <0,001;) (   29   ) и снижение уровня ацетил-р53 в гипоталамусе через 2 часа ( F 1,13 = 7,915, P <0,01;) и через 6 часов ( F 1,13 = 7,645, P <0,05;)

Влияние состояния питания на гипоталамус SIRT1. A : Пост в течение 48 часов вызывал значительное ( P <0,001) снижение массы тела, тогда как повторное кормление в течение 24 часов частично восстанавливало потерю веса. B : Уровни ацетилированного p53 в гипоталамусе снижались у голодных крыс и восстанавливались у крыс с рафинированием. Влияние интрацеребровентрикулярной инъекции грелина (5 мкг / крыса) через 2 ч на потребление пищи ( C ) и уровни ацетилированного p53 в гипоталамусе ( D ). Влияние интрацеребровентрикулярной инъекции грелина (5 мкг / крыса) через 6 ч на потребление пищи ( E ) и уровни ацетилированного p53 в гипоталамусе ( F ). Значения были нормализованы по сравнению с внутренним контролем β-актина, а результаты выражены в произвольных единицах. Средние значения были получены от шести животных на группу. Значения являются средними ± SEM. * Р <0,05, ** Р <0,01, *** Р <0,001.

Блокада пути SIRT1 / p53 притупляет орексигенное действие грелина.

Затем мы изучили функциональную значимость этих результатов, оценивая, может ли фармакологическая блокада активности SIRT1 регулировать орексигенное действие грелина. Во-первых, мы наблюдали, что центральная инъекция Ex527, мощного ингибитора активности SIRT1, увеличивала уровни ацетил-р53 в гипоталамусе при различных дозах (1, 5 и 10 мкг; Дополнительный рис. 1 А ), что указывает на то, что это соединение снижало гипоталамическую активность SIRT1 in vivo. Затем мы централизованно вводили грелин, Ex527 и Ex527 + грелин крысам. Мы обнаружили, что грелин увеличивал потребление пищи через 2 ч (данные не показаны) и через 6 ч ( F 3,27 = 12,282, р <0,001;), но когда ингибитор SIRT1 вводили за 20 мин до грелина, орексигенное действие грелина было заметно притупляется через 6 ч (). Поскольку грелин увеличивает потребление пищи за счет его влияния на метаболизм жирных кислот в гипоталамусе ( 5 , 6 Затем мы оценили уровни нескольких ключевых ферментов для синтеза липидов. Мы обнаружили, что через 6 ч после интрацеребровентрикулярной инъекции грелина уровни pAMPK были повышены ( F 3,28 = 2,445, P <0,05), но уровни ACC снизились ( F 3,27 = 6,045, P <0,01). Эти эффекты были отменены при одновременном назначении ингибитора SIRT1 ().

Эти эффекты были отменены при одновременном назначении ингибитора SIRT1 ()

Фармакологическая блокада SIRT1 притупляет орексигенное действие грелина. A : Влияние интрацеребровентрикулярной инъекции грелина (5 мкг / крыса), Ex527 (1 мкг / крыса) и грелина + Ex527 на потребление пищи через 6 часов. Гипоталамические уровни белка pAMPKα, AMPKα1, AMPKα2, pACC, ACCα, FAS ( B и C ), pCREB, FoxO1 ( D ) и Bsx, NPY и AgRP ( E и F ) после 6 ч введения грелина и Ex527. Значения были нормализованы по сравнению с внутренним контролем β-актина, а результаты выражены в произвольных единицах. Средние значения были получены от шести животных на группу. Значения являются средними ± SEM. * Р <0,05, ** Р <0,01, *** Р <0,001.

Важно отметить, что хотя уровни pAMPK были повышены, pACC не достиг статистической значимости, возможно, из-за разной кинетики фосфорилирования обоих ферментов ( 6 ). Кроме того, более высокая экспрессия транскрипционных факторов FoxO1 ( F 3,27 = 2,509, P <0,05), pCREB ( F 3,26 = 3,668, P <0,05;) и Bsx ( F 3,26 = 3,526, P < 0,05;) и нейропептиды NPY ( F (3,26) = 4,362, P <0,05) и AgRP ( F 3,26 = 3,33, P <0,05;) в дугообразном ядре гипоталамуса, вызванном грелином, также были отменены, когда SIRT1 ингибитор был назначен одновременно. Когда мы использовали sirtinol, другой ингибитор активности SIRT1, результаты были аналогичны тем, которые были получены с Ex527 ( Дополнительный рис. 1 ).

Белок-супрессор опухолей p53 является субстратом SIRT1, и он обнаружен гиперацетилированным у мышей SIRT1 KO ( 30 ). Потому что недавний отчет показал, что р53 участвует в энергетическом обмене и гомеостазе ( 31 Затем мы поинтересовались, может ли p53 быть медиатором SIRT1-зависимых эффектов грелина. С этой целью мы обрабатывали мышей WT и p53 KO интрацеребровентрикулярным грелином, следуя тому же протоколу, что и описанный выше. У мышей р53 КО не было изменений в массе тела, потреблении пищи, жировой массе или нежирной массе по сравнению с однопометными WT ( Дополнительный рис. 2 A - D ). Как и ожидалось, центральное введение грелина увеличивало потребление пищи у животных WT, тогда как идентичное внутрицеребровентрикулярное лечение грелином у животных р53 КО не влияло на потребление пищи через 2 () или 6 ч ().

Как и ожидалось, центральное введение грелина увеличивало потребление пищи у животных WT, тогда как идентичное внутрицеребровентрикулярное лечение грелином у животных р53 КО не влияло на потребление пищи через 2 () или 6 ч ()

Мыши без p53 не реагируют на инъекцию грелина. Влияние интрацеребровентрикулярной инъекции грелина (5 мкг / мышь) на потребление пищи через 2 часа ( A ) и 6 часов ( B ) у мышей WT и p53 KO. Гипоталамические уровни белка pAMPKα, AMPKα1, AMPKα2, pACC, ACCα и FAS через 6 ч после инъекции грелина ( C и D ). Значения были нормализованы по сравнению с внутренним контролем β-актина, а результаты выражены в произвольных единицах. Средние значения были получены от шести животных на группу. Значения являются средними ± SEM. * Р <0,05, ** Р <0,01.

Затем мы оценили уровни нескольких ключевых ферментов для синтеза липидов. Не было обнаружено принципиальных различий между мышами WT и p53 KO в отношении экспрессии AMPKα1, AMPKα2 или FAS (). Примечательно, что мы обнаружили, что через 6 ч после его центральной инъекции грелин увеличил уровни pAMPK у мышей WT ( F 1,12 = 4,466, P <0,05), но не смог этого сделать у мышей p53 KO (), предполагая, что p53 является незаменимый посредник действий грелина на АМПК. Уровни pAMPK и pACC коррелируют в нормальных условиях; однако мы обнаружили, что уровни pACC в гипоталамусе подавляются у мышей p53 KO ( F 1,12 = 8,576, P <0,01), но не у мышей WT ().

Хотя у нас нет четкого объяснения этих результатов, похоже, что грелин способен активировать ACC, когда p53 отсутствует, предполагая, что p53 может также регулировать действия грелина на различные ключевые ферменты, модулирующие метаболизм жирных кислот. Дальнейшие исследования, анализирующие не только уровни белка, но также ферментативную активность и липолиз / липогенез, будут необходимы для решения этой проблемы. Кроме того, мы обнаружили, что центральная инъекция грелина снижала уровни ACCα как у мышей WT ( F 1,12 = 2,844, P <0,05), так и у мышей p53 KO ( F 1,12 = 6,699, P <0,01;), указывая на то, что p53 не является существенным для опосредованного грелином регулирования ACC.

р53 не опосредует орексигенное действие AICAR.

Центральная инъекция AICAR, мощного активатора активности AMPK, стимулирует потребление пищи у грызунов ( 32 ). Чтобы определить, является ли р53 критическим игроком для орексигенного действия AICAR, мы централизованно лечили мышей р53 КО с помощью AICAR (3 мкг) и обнаружили стимуляцию потребления пищи через 6 ч ( F 1,12 = 3,554, P <0,05;) , Гипоталамические уровни pAMPK также увеличивались у мышей p53 KO, получавших AICAR ( F 1,12 = 4,479;). Таким образом, наши данные указывают на то, что р53 не требуется для орексигенного действия прямых активаторов AMPK.

Таким образом, наши данные указывают на то, что р53 не требуется для орексигенного действия прямых активаторов AMPK

Центральная инъекция AICAR увеличивает потребление пищи у мышей р53 КО. A : Влияние интрацеребровентрикулярной инъекции AICAR (3 мкг / мышь) на потребление пищи через 6 ч у мышей р53 КО. B и C : уровни белков гипоталамуса pAMPK, pACC, AMPKα1, AMPKα2, ACCα и FAS через 6 ч после введения AICAR. Значения были нормализованы по сравнению с внутренним контролем β-актина, а результаты выражены в произвольных единицах. Средние значения были получены от шести животных на группу. Значения представляют собой среднее ± SEM, * P <0,05.

Центральный путь SIRT1 не модулирует индуцированную грелином секрецию GH.

Наконец, мы оценили, опосредует ли путь SIRT1 другие нейроэндокринные действия грелина, а именно секрецию ГР. Администрация грелина ( 27 ) привело к ожидаемому повышению уровня GH в плазме через 5, 10 и 15 мин (), тогда как центральная блокада SIRT1 не изменила этот ответ (). Грелин проявлял сходный стимулирующий эффект как в области под кривой, так и в средних пиковых уровнях GH ().

Грелин проявлял сходный стимулирующий эффект как в области под кривой, так и в средних пиковых уровнях GH ()

Фармакологическая блокада SIRT1 не модифицирует индуцированную грелином секрецию гормона роста. A : Влияние внутривенной инъекции грелина (12 нмоль / кг), интрацеребровентрикулярного Ex527 (1 мкг / крыса) и грелина + Ex527 на уровни GH в плазме у свободно движущихся крыс взрослых самцов. Площадь под кривой (AUC) ( B ) и средние пиковые уровни GH ( C ). Средние значения были получены от шести животных на группу. Значения представляют собой среднее ± SEM. * Р <0,05, ** Р <0,01.

ОБСУЖДЕНИЕ

Наши текущие данные показывают, что гипоталамический путь SIRT1 / p53 имеет решающее значение для орексигенного эффекта грелина. Фармакологическое ингибирование SIRT1 или генетическое истощение p53 устраняет эффекты грелина на AMPK и тем самым притупляет индуцированное грелином действие на факторы транскрипции, включая pCREB, FoxO1 и Bsx, и нейропептиды, такие как NPY и AgRP, что приводит к подавлению грелина -индуцированный прием пищи.

SIRT1 представляет собой деацетилазу, которая регулирует обмен веществ в нескольких периферических тканях. Недавно сообщалось, что мРНК SIRT1 находится в метаболически значимых областях нейроаксиальных мышей, таких как про-опиомеланокортиновые нейроны, которые имеют решающее значение для гомеостаза энергии и глюкозы ( 11 ). Похоже, что SIRT1 регулирует центральную систему меланокортинов ( 13 ) и что специфическое отсутствие SIRT1 в мозге устраняет более высокую физическую активность, вызванную ограничением калорий ( 12 ). Более конкретно, отсутствие SIRT1 в про-опиомеланокортиновых нейронах вызывает гиперчувствительность к ожирению, вызванному диетой, из-за снижения расхода энергии ( 17 ). В соответствии с этими данными мы наблюдали, что ацетилирование р53 в гипоталамусе снижается после лишения пищи, что указывает на то, что SIRT1 как деацетилаза повышает свою гипоталамическую активность во время голодания. Следовательно, регуляция активности SIRT1 в гипоталамусе по состоянию питания аналогична регуляции в некоторых периферических тканях ( 33 ).

Грелин - это желудочный гормон, который быстро увеличивает потребление пищи и массу тела ( 1 , 29 ). Его регулирование по состоянию питания было спорным, потому что анализы выявляли ацил-грелин и де-ацил-грелин и, таким образом, не были специфичными. Исследования с использованием новых технологий для отдельного обнаружения обеих изоформ показывают, что циркулирующий деацилгрелин значительно увеличивается с голоданием, тогда как уровни ацил-грелина в крови не изменяются в течение голодания ( 34 , 35 ). Большинство эффектов грелина проявляется через рецептор 1А секретагога GH (GHS-R1a) ( 36 ), который экспрессируется в нейронах AgRP / NPY в дугообразном ядре гипоталамуса ( 37 ). Орексигенный эффект грелина опосредован AMPK, ключевым восходящим основным регулятором метаболизма липидов ( 5 , 6 ). Однако молекулярные события, регулирующие фосфорилирование AMPK после активации GHS-R1a, неизвестны.

В настоящей работе мы демонстрируем, что центральное введение грелина повышает активность SIRT1 в гипоталамусе, стимулируя деацетилирование р53. Более интересно и согласуется с предыдущими выводами ( 14 ), блокада центральной активности SIRT1 отменила мощный орексигенный эффект грелина. На молекулярном уровне индуцируемая грелином активация AMPK предотвращается, когда активность SIRT1 блокируется. Взаимодействие между SIRT1 и AMPK было ранее показано in vitro, что указывает на то, что ресвератрол активирует AMPK в нейронах ( 38 ).

Хотя фармакологические эксперименты, основанные на введении ингибиторов SIRT1 на животных моделях, обеспечивают важное понимание основных эффектов, целей и механизмов системы SIRT1, для понимания функции ее эндогенной роли требуются более сложные подходы, такие как генетическое нарушение SIRT1 или его субстраты. Мы сфокусировались на p53, потому что этот белок-супрессор опухолей является хорошо известной мишенью действия SIRT1, и есть все больше свидетельств его роли в метаболизме и энергетическом балансе в периферических тканях ( 31 ). Наши результаты показывают, что р53 необходим для приема пищи, вызванной грелином, потому что грелин не смог увеличить потребление пищи у мышей р53 КО. В соответствии с фармакологическими данными грелин стимулировал уровни pAMPK в гипоталамусе у мышей WT, но у мышей p53 KO этого не было. С другой стороны, было показано, что SIRT1 является целевым геном р53 в некоторых, но не во всех тканях ( 31 , 39 ), таким образом, возможно, что p53 опосредует изменения в SIRT1 при лечении грелином или ограничением калорий. Однако наблюдаемая корреляция между активностью ацетилированного р53 и SIRT1 в гипоталамусе в различных экспериментальных условиях указывает на то, что р53 является важным медиатором SIRT1-зависимых эффектов грелина на AMPK. Мыши, у которых отсутствует р53 в определенных областях гипоталамуса, будут важны для демонстрации того, какие именно нейронные цепи ответственны за эти действия. Однако, центральный путь SIRT1 / p53 не требуется для прямых активаторов AMPK, потому что AICAR стимулировал потребление пищи у мышей с дефицитом p53. Следовательно, эти данные подтверждают, что центральный путь SIRT1 / p53 не связан с AICAR-индуцированной активацией AMPK.

Наконец, наши результаты показывают, что грелин стимулировал выброс GH, как и ожидалось, но блокада центрального SIRT1 не модифицировала уровни GH. Следовательно, кажется, что центральный путь SIRT1 / p53 специфически опосредует действие греклина орексигенного и предполагает, что различные нейрональные пути модулируют индуцированный грелином прием пищи и секрецию ГР.

Таким образом, мы предоставляем комбинацию фармакологических и генетических данных, чтобы продемонстрировать, что путь SIRT1 / p53 в центральной нервной системе важен для орексигенной реакции на грелин (). Молекулярный путь, опосредующий эти эффекты, включает изменения в активации AMPK, что приводит к изменениям метаболизма жирных кислот в гипоталамусе и, наконец, изменяет пищевое поведение.

Молекулярный путь, опосредующий эти эффекты, включает изменения в активации AMPK, что приводит к изменениям метаболизма жирных кислот в гипоталамусе и, наконец, изменяет пищевое поведение

Схематический обзор, суммирующий нашу предложенную модель для молекулярных механизмов, инициируемых активацией рецептора грелина, приводящей к активации AMPK и, наконец, к усиленному поведению при кормлении. АФК, активные формы кислорода; СРТ, карнитин пальмитоилтрансфераза; UCP, разобщающий белок. (Высококачественное цветовое представление этой фигуры доступно в онлайн-выпуске.)